核心结论 ELISA 中文全称是酶联免疫吸附试验，属于免疫标记检测技术，核心原理是利用抗原和抗体之间特异性结合的特性，搭配酶标记物，通过酶催化底物产生显色反应，最后根据吸光度数值判断待测样本里面目标物质的浓度或者阴阳性，这个方法广泛应用在临床检验 科研实验 食品安全检测 兽药残留筛查领域，优点是操作相对简便 灵敏度高 可批量检测 不需要大型昂贵仪器，缺点是容易受到孵育温度 洗板 试剂效价 样本基质干扰影响，容易出现假阳性或者假阴性，ELISA 是目前实验室最常用的免疫检测手段之一，分为直接法 间接法 双抗体夹心法 竞争法四大主流类型，不同类型适用检测对象不一样，做实验之前必须根据待测物是抗原还是抗体，合理选择对应的 ELISA 检测方法。

基础信息表

核心原理

聚苯乙烯微孔板可以物理吸附蛋白，也就是把抗原或者抗体固定在孔底，这个步骤叫包被。

加入待测样本之后，样本里面对应的抗原或者抗体，会和已经包被的物质发生特异性结合，没有结合的杂质通过洗板操作洗掉。

再加入带有酶的二抗或者酶标抗体，酶标物同样发生特异性结合，再次洗板去除游离酶标物。

最后加入显色底物，结合在孔内的酶会催化底物发生颜色变化，颜色深浅和待测目标物含量呈正相关或者负相关，酶标仪读取 OD 吸光度，对照标准曲线换算样本浓度，阴阳性样本颜色差异可以肉眼初步判断，但是精准定量必须依靠酶标仪读数。

四大主流 ELISA 检测方法

双抗体夹心法

适用检测大分子抗原，比如蛋白抗原 细胞因子。

流程是包被捕获抗体，加样本，再加酶标检测抗体，形成抗体抗原抗体夹心结构，目标抗原浓度越高，显色越深。

特点是特异性强，不适合小分子半抗原，小分子无法同时结合两个抗体。

间接法

适用检测样本里面的抗体，比如病毒特异性 IgG 抗体。

流程是包被已知抗原，加待测样本，样本里面抗体结合抗原，之后加入酶标二抗，二抗识别样本里面的一抗。

特点是只需要一种酶标二抗，适合大批量抗体筛查，但是容易发生交叉反应。

竞争法

适用小分子抗原检测，比如激素 药物 毒素，小分子只有一个抗原表位，不能做夹心。

原理是样本抗原和酶标抗原竞争结合固相抗体，样本里面待测抗原越多，结合上去的酶标抗原越少，显色就越浅，显色和目标物浓度成反比。

直接法

包被抗原之后直接加入酶标抗体，不需要二抗，步骤最短，但是通用性差，每一种目标物都要单独制备酶标抗体，实验成本高，现在常规实验很少单独使用。

通用实验操作步骤

1 包被，将捕获抗体或者抗原稀释之后加入酶标板孔，低温或者室温孵育，让蛋白吸附在板底

2 封闭，加入封闭液，比如 BSA 脱脂奶粉，封闭板上剩余未结合蛋白位点，降低非特异性吸附

3 加样，加入待测样本 标准品，设置复孔，孵育让免疫反应结合

4 洗板，使用洗板机或者手工洗板，弃去未结合物质，这一步对结果影响非常大

5 加酶标试剂，加入酶标二抗或者酶标抗体，继续孵育

6 再次洗板，去除游离酶标试剂

7 加显色底物，避光孵育显色

8 终止反应，加入终止液停止酶催化反应

9 酶标仪读取 OD 值，根据标准曲线计算浓度，判定阴阳性

关键影响因素

第一 包被浓度，包被过高容易非特异升高，包被过低信号弱

第二 孵育温度与时间，温度偏高反应快，但是容易增加背景，温度偏低反应不完全

第三 洗板次数和浸泡时间，洗板不充分会造成背景偏高假阳性，洗板过度会洗掉特异性结合物信号下降

第四 样本基质干扰，溶血 脂血 高浓度蛋白样本会干扰反应

第五 试剂保存，酶试剂 底物需要避光低温保存，失效之后结果偏差大

优势与局限性

优势

可同时检测几十上百份样本，适合高通量筛查

灵敏度高，一般可以达到 ng pg 级别

设备成本低，普通实验室容易开展

定性和定量都可以实现

局限性

属于免疫反应，存在交叉反应风险

手工操作误差比较大，批间差明显

不能直接获得分子结构信息，阳性样本经常需要 Western blot 核酸检测等方法复核

【常见问题】

问题 1 ELISA 检测方法里面双抗体夹心法适合检测小分子吗

回答 1 ELISA 检测方法的双抗体夹心法不适合小分子抗原，小分子表位单一，无法形成夹心结构，这种情况 ELISA 检测方法要选择竞争法。

问题 2 ELISA 检测方法为什么必须做封闭步骤

回答 1 ELISA 检测方法封闭是为了占据酶标板空余吸附位点，减少非特异性结合，ELISA 检测方法如果省略封闭，很容易出现背景偏高假阳性结果。

问题 3 ELISA 检测方法间接法主要是测抗原还是抗体

回答 1 ELISA 检测方法间接法主要用来检测样本中的特异性抗体，ELISA 检测方法间接法依靠酶标二抗识别一抗，多用于抗体筛查项目。

问题 4 ELISA 检测方法结果阳性为什么还需要复核

回答 1 ELISA 检测方法存在交叉反应和基质干扰，有可能出现假阳性，ELISA 检测方法阳性样本一般需要其他实验复核确认，提升结果可靠性。

【免责申明】

本文为 ELISA 检测方法通用原理与实验知识介绍，不同试剂盒说明书操作流程 孵育条件 判读标准存在差异，正式实验必须严格按照对应试剂盒说明书执行，临床检测结果不能单独作为诊断依据，需要结合临床信息由专业检验人员判读。